Für Bakterien braucht ein Mikroskop mindestens 400fache Vergrößerung, damit Zellen als einzelne Punkte oder Stäbchen erkennbar werden, und 1000fache mit einem Ölimmersionsobjektiv, damit Form und Anordnung eindeutig werden. Alles darunter zeigt bestenfalls ein Flimmern. Ein Tropfen Heuaufguss, der drei Tage am Fenster stand, macht den Unterschied anschaulich. Bei 100facher Vergrößerung wirkt das Wasser leer, abgesehen von ein paar Wimperntierchen, die als große Schatten durchs Bild ziehen. Bei 400facher Vergrößerung wimmelt es plötzlich von winzigen Punkten, die ruckartig die Richtung wechseln. Erst bei 1000facher Vergrößerung bekommen diese Punkte Gestalt: kurze Stäbchen, die sich an den Enden aneinanderreihen, dazwischen runde Zellen.
Hinter diesen Zahlen steckt eine einfache Überlegung. Ein Bakterium misst meist zwischen 0,5 und 5 Mikrometer, das Darmbakterium Escherichia coli etwa einen Mikrometer in der Breite und zwei bis drei in der Länge. Das Auge trennt aus 25 Zentimetern Entfernung zwei Punkte erst ab rund 0,1 Millimeter Abstand, das sind 100 Mikrometer. Eine Zelle von einem Mikrometer muss also schon 100fach vergrößert werden, um überhaupt die Größe eines gerade noch erkennbaren Flecks zu erreichen. Ein Bild von einem Millimeter Durchmesser, an dem sich eine Form ablesen lässt, verlangt das Tausendfache.
Warum 400fach reicht, um Bakterien zu finden
Bei 400facher Vergrößerung, also Objektiv 40fach und Okular 10fach, erscheint ein Stäbchen von zwei Mikrometern Länge 0,8 Millimeter groß. Das genügt, um Beweglichkeit zu beurteilen: Schwimmende Bakterien zeigen gerichtete Bahnen, während Teilchen, die nur zittern, der Brownschen Molekularbewegung folgen. Dieser Unterschied ist die häufigste Frage in Schulpraktika und lässt sich bei 400fach gut klären. Zugleich steht das Objektiv 40fach mit einem Arbeitsabstand von gut einem halben Millimeter weit genug über dem Deckglas, sodass ein Zusammenstoß kaum passiert.
Für die Frage, ob in einer Probe überhaupt Bakterien vorhanden sind, ist 400fach somit die praktische Grundlage. Kugelförmige Bakterien mit 0,8 bis 1 Mikrometer Durchmesser, die Staphylokokken zum Beispiel, wirken bei dieser Stufe wie feiner Sand von 0,3 bis 0,4 Millimeter Korngröße. Ob einzelne Kugeln, Paare oder Trauben vorliegen, bleibt offen, denn die Anordnung zeigt sich erst bei der Ölimmersion. Beim ersten Versuch beginnt die Suche deshalb mit 100fach, um die Probe zu finden und scharf zu stellen, danach folgt 400fach für Bewegung und Menge und erst zuletzt kommt das Ölobjektiv. Dieser Ablauf spart Öl, Zeit und Nerven, denn eine Probe, die bei 100fach schon keine Trübung zeigt, enthält selten genug Zellen für einen Blick bei 1000fach.
Wo die nützliche Vergrößerung endet
Mehr Vergrößerung bedeutet nicht mehr Information. Die Trennschärfe eines Lichtmikroskops hängt allein vom Objektiv ab, genauer von dessen numerischer Apertur, die neben der Vergrößerung eingraviert ist, etwa 40/0,65 oder 100/1,25. Wie sich daraus die Grenze der Trennschärfe ergibt, steht im Beitrag darüber, welches Mikroskop Atome zeigt. Für Bakterien genügt das Ergebnis: Bei einer Wellenlänge von 550 Nanometern trennt ein Trockenobjektiv 40/0,65 zwei Punkte ab etwa 420 Nanometern Abstand, ein Ölobjektiv 100/1,25 ab etwa 220 Nanometern.
Daraus folgt die Faustregel der nützlichen Vergrößerung, nämlich das 500 bis 1000fache der numerischen Apertur. Beim Objektiv 40/0,65 reicht der Bereich damit von 325 bis 650. Ein Okular 10fach ergibt 400 und passt, ein Okular 20fach ergibt 800 und erzeugt nur ein größeres, flaueres Bild, die sogenannte leere Vergrößerung. Beim Ölobjektiv 100/1,25 reicht der Bereich von 625 bis 1250, sodass 1000fach mitten darin liegt. Eine eigene Falle sind Digitalmikroskope und Handy Aufsätze. Angaben wie 1600fach oder 2000fach rechnen den Monitor mit ein, ein Objektiv mit Apertur 0,25 trennt aber erst Punkte ab 1,1 Mikrometer Abstand, und kein Pixel macht daraus ein Bakterium mit erkennbarer Gestalt. Entscheidend ist darum die Zahl hinter dem Schrägstrich auf dem Objektiv.
Warum ungefärbte Bakterien trotzdem verschwinden
Bakterienzellen bestehen zu rund 70 Prozent aus Wasser, der Brechungsindex liegt bei etwa 1,38 gegenüber 1,33 für das umgebende Wasser. Das Licht wird kaum abgelenkt oder abgeschwächt, die Zelle bleibt ein Phantom. Selbst ein perfektes Objektiv liefert im Hellfeld dann nur einen schwachen Schatten, und genau hier scheitern die meisten ersten Versuche. Drei Hebel verbessern das Bild. Erstens die Kondensorblende: Wird sie auf etwa zwei Drittel der Objektivöffnung geschlossen, steigt der Kontrast spürbar, die Trennschärfe sinkt dafür leicht. Bakterien in dünnen Ausstrichen gewinnen dadurch mehr, als sie verlieren, denn das Problem ist der fehlende Kontrast und nicht die Feinheit.
Zweitens die Färbung. Ein Tropfen Probe wird auf dem Objektträger dünn ausgestrichen, an der Luft getrocknet, dreimal kurz durch die Flamme gezogen und mit Methylenblau oder Kristallviolett eingefärbt. Nach einer Minute wird gespült und getrocknet, danach folgt das Ölobjektiv. Drittens Dunkelfeld oder Phasenkontrast. Ein Dunkelfeld lässt sich notfalls mit einer runden Pappscheibe im Filterhalter unter dem Kondensor nachbilden, am besten mit dem Objektiv 10fach oder 20fach. Die Zellen leuchten dann hell auf schwarzem Grund, und sogar Spirochäten mit nur 0,2 Mikrometer Dicke verraten sich als feine Lichtfäden, obwohl sie unter der Trenngrenze des Objektivs liegen. Formdetails bleiben dabei allerdings verborgen.
Was das Ölobjektiv anders macht
An der Grenze zwischen Glas und Luft wird Licht ab einem bestimmten Winkel vollständig zurückgeworfen. Die numerische Apertur eines Trockenobjektivs kommt deshalb praktisch nie über 0,95. Immersionsöl mit dem Brechungsindex 1,515, fast identisch mit Glas, schließt den Luftspalt zwischen Deckglas und Frontlinse und hebt die Apertur auf 1,25 bis 1,4. Daraus entsteht der Sprung von 420 auf 220 Nanometer Trennabstand, der bei Bakterien über Erkennen und Nichterkennen der Form entscheidet. Ein Tropfen genügt, mehr verschlechtert das Bild durch Blasen.
Das Ölobjektiv stellt Ansprüche an die Handhabung. Der Arbeitsabstand beträgt bei 100fach nur etwa 0,15 bis 0,2 Millimeter, bei einem Deckglas von 0,17 Millimeter Dicke bleibt wenig Spielraum. Das Objektiv wird deshalb mit dem Auge von der Seite bis zum Ölkontakt abgesenkt und erst danach mit dem Feintrieb scharf gestellt. Nach der Arbeit wird das Öl mit Linsenpapier abgetupft, niemals gerieben, und nie mit Alkohol getränkt, der den Kitt der Frontlinse löst. Ein Kondensor mit Apertur 1,25 bräuchte für den vollen Wert ebenfalls einen Tropfen Öl unter dem Objektträger. Ohne den Tropfen bleibt die Beleuchtung bei etwa 0,95 stehen, was im Schulbetrieb dennoch ausreicht.
Welche Ausstattung zum Ziel führt
Ein Mikroskop für Bakterien braucht keinen Aufpreis für große Zahlen, sondern für die richtigen. Ein Revolver mit den Objektiven 4fach, 10fach, 40fach und 100fach Öl deckt den gesamten Weg von der Suche bis zur Formbeurteilung ab. Ein Okular 10fach ist die vernünftige Wahl, weil es das Bild nicht über den nützlichen Bereich hinaus aufbläht. Eine LED Beleuchtung mit Helligkeitsregler erspart die Hitze von Halogenlampen, die den Probentropfen austrocknen lässt, was die Beweglichkeit der Zellen verfälscht. Ein Kreuztisch erlaubt es, das Präparat in Schritten von einem Zehntelmillimeter zu verschieben, was bei 1000fach Pflicht ist, denn das Bildfeld misst dort nur etwa 0,2 Millimeter im Durchmesser, und ein von Hand geschobener Objektträger springt um ein Mehrfaches davon.
Spielzeug und Taschenmikroskope enden meist bei 40fach bis 100fach mit einem Kunststoffobjektiv der Apertur 0,1 bis 0,25. Taschengeräte sind für Kinder und erste Eindrücke in Ordnung. Mit ihnen lassen sich Pantoffeltierchen und Hefezellen beobachten, Bakterien jedoch bleiben Rauschen am Rand des Machbaren. Ein einfaches Schulmikroskop mit Metallstativ, Kondensor mit Irisblende, Kreuztisch und echtem Ölobjektiv liegt in einer anderen Klasse, auch wenn die aufgedruckte Maximalzahl kleiner ausfällt. Zur Entscheidung helfen die folgenden Punkte:
- Zuerst auf dem Objektiv nach der Aperturzahl schauen: Ohne 0,65 beim 40fach und ohne 1,25 beim 100fach lassen sich Bakterien kaum beurteilen.
- Das Okular 10fach genügt, größere Okulare erzeugen nur leere Vergrößerung.
- Ein Kondensor mit Irisblende ist Pflicht, weil sich nur damit der Kontrast einstellen lässt.
- Methylenblau, Objektträger, Deckgläser, Immersionsöl und Linsenpapier gehören zur Grundausstattung und kosten zusammen wenig.
- Angaben für Digitalmikroskope und USB Kameras werden mit dem Faktor des Monitors multipliziert und sagen über die Trennschärfe nichts aus.
